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无菌检查法之无菌室的准备

无菌检查法是检查供试品是否有活细菌-真菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

       无菌检查应在无菌条件下进行,试验环境必须达到无菌检查要求,检验全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染,并且,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

       本文内容参照《中国药典》(2015年版)四部中的无菌检查法及相关指导原则确定。

       仪器设备及试剂

       仪器

       超净工作台、生物安全柜、恒温培养箱、集菌仪、显微镜、蒸汽灭菌器、天平等。

       用具

       试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管(1ml、5ml、10ml)、注射器(2ml、5ml、10ml)、双碟(90mm)、无菌衣、口罩、灭菌袋或牛皮纸、剪刀、镊子、钳子等常用工器具。

       培养基和试剂

       硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、0.9%无菌氯化钠溶液、75%(V/V)乙醇、碘酊溶液、新洁尔灭(1∶1000)溶液、3%~5%甲酚溶液或其他适宜消毒溶液、精密pH试纸、2mol/L氢氧化钠溶液等。

       无菌室准备

       无菌检查法的检验步骤包括无菌室准备、培养基灵敏度检查、方法适用性试验、供试品的无菌检查。本文对“无菌室准备”的相关内容进行介绍。

       微生物实验室应具有进行微生物检测所需的适宜、充分的设施条件,且应保证实验环境不影响检验结果的准确性。工作区域应与办公区域分开。微生物实验室应为专用,并与其他领域尤其是生产领域分开。

       微生物实验室的布局、设计应充分考虑到试验设备安装、良好微生物实验室操作规范和实验室安全的要求。实验室布局设计的基本原则是:既要最大限度地防止微生物污染,又要防止检验过程对人员和环境造成危害,还应考虑活动区域的合理规划,以避免混乱和污染,提高微生物实验室操作的可靠性。

       微生物实验室的设计及所用建筑材料的选择应考虑其适用性,以利于清洁、消毒、灭菌,并减少污染风险。洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系统,以满足相应检验要求,温度和湿度控制、压力、照度和噪声等也应符合工作要求。空气过滤系统应定期维护和更换,并保存相关记录,微生物实验室应划分成相应的洁净区域和活菌操作区域。同时,应根据试验目的,在时间及空间上有效分隔不相容的实验活动,将交叉污染的风险降至最低。活菌操作区应配备生物安全柜,以避免有危害性的生物因子对实验人员和实验环境造成危害。一般情况下,药品微生物检验实验室应有符合无菌检查法和微生物限度检查要求,并用于开展无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等检测活动独立的洁净室(区)或隔离系统,并配备相应的阳性菌实验室、培养室、试验结果观察区、培养基及实验用具准备(包括灭菌)区、样品接收和贮藏室(区)、标准菌株贮藏室(区)、污染物处理区和文档处理区等辅助区域。同时,应对上述区域进行明确标识。

       微生物实验的各项工作应在专属区域进行,以降低假阳性结果和假阴性结果出现的风险。无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域或隔离系统中进行,A级和B级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器实现。

       若需要证明微生物的生长或进一步分析培养物的特性(如再培养、染色、微生物鉴定或其他确定试验),应在实验室的活菌操作区进行。任何出现微生物生长的培养物均不得在实验室无菌区域内打开。应对染菌的样品及培养物进行有效隔离,以减少假阳性结果的出现。病原微生物的分离鉴定工作应在二级生物安全实验室进行。

       实验室应制定进出洁净区域的人和物的控制程序和标准操作规程,对可能影响检验结果的工作(如洁净度验证及监测、消毒、清洁维护等)进行有效控制、监测和记录。微生物实验室的使用权限应限于经授权的工作人员,实验人员应了解洁净区域的正确进出程序(包括更衣流程),以及该洁净区域的预期用途、使用限制及原因、适当的洁净级别。

       微生物实验室应按照相关国家标准制定完整的洁净室(区)和隔离系统验证及环境监测标准操作规程,环境监测项目、频率及对超标结果的处理应有书面程序。监测项目应包括对空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物及物理参数(温度、相对湿度、换气次数、气流速度、压差、噪声等)的有效控制与监测。环境监测按药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则[《中国药典》(2015年版)四部通则9205]的内容进行。

       微生物实验室应制定清洁、消毒和卫生的标准操作规程,规程中应涉及环境监测结果。应在使用前和使用后对实验室进行消毒,且定期监测消毒效果,并配有足够的洗手和手消毒设施。

       所用消毒剂应满足洁净实验室相关要求,并定期更换。理想的消毒剂既能杀死大量微生物,还应对人体无毒害,不会腐蚀或污染设备。应对所用消毒剂和清洁剂的微生物污染状况进行监测,并在规定有效期内使用,A级和B级洁净区应使用无菌的或经无菌处理的消毒剂和清洁剂。

       洁净实验室应定期进行微生物监测,包括非生物活性的空气悬浮粒子数和有生物活性的微生物监测。其中,微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测,及对关键检测台面、人员操作服表面及五指手套等的微生物监测。

       当洁净区的超净工作台、空气调节系统等关键设备发生重大改变时,应重新监测。若微生物监测结果或样品测定结果产生偏离,经评估发现洁净区可能存在被污染的风险时,应在对洁净区清洁消毒后重新进行监测。

       洁净实验室悬浮粒子的监测参照《医药工业洁净室(区)悬浮粒子的测试方法》规定的标准进行;沉降菌的监测参照《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》规定的标准进行;浮游菌的监测参照《医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法》规定的标准进行。

       表面微生物测定是对环境、设备和人员的表面微生物进行监测,方法包括接触碟法和擦拭法。接触碟法是将充满规定的琼脂培养基的接触碟对规则表面或平面取样,然后置于合适的温度下培养一定时间并计数,每碟取样面积约为25cm2,微生物计数结果以cf u/碟报告。擦拭法是接触碟法的补充,用于不规则表面的微生物监测,特别是设备的不规则表面。擦拭法的擦拭面积应采用合适尺寸的无菌模板或标尺确定,取样后,将拭子置于合适的缓冲液或培养基中,充分振荡,然后采用适宜的方法计数,每个拭子取样面积约为25cm2,微生物计数结果以cf u/拭子报告。接触碟法和擦拭法采用的培养基、培养温度和时间同于浮游菌或沉降菌监测。

       表面菌测定应在实验结束后进行。环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基,必要时可加入适宜的中和剂,当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时,可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基。


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